荧光定量PCR仪选择误区及注意要点

荧光定量PCR 因操作方便、运行速度快、实验结果准确，受到越来越多的分子生物学研究者青睐。面对各种不同性能的产品，您又该如何选择呢？

首先建议大家走出认识荧光定量PCR的两个误区：

误区一：仪器通道越多越好

随着PCR技术的成熟运用，多重扩增越来越热闹，荧光定量PCR仪也不能幸免。从zui初ABI公司推出的单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪，眼花缭乱的选择让人无所适从，就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。

在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时，为了确保实验结果的性和准确性都要在实验中使用ROX（一种荧光染料）或的Reference dye ，这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来，真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个，而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的的荧光染料或试剂开放的，有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要，不能单单只听宣传。

考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发，多重PCR并非人人适用、人人可用，因为它使实验复杂化了。

误区二：real-time PCR仪无需梯度功能

对于使用染料法的定量PCR反应，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度（Tm值），但运用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果，退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出的反应条件。

不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要，因为Taq和校正酶的*反应温度可能有显著差异，优化延伸温度就显得很重要。

使用有梯度功能的荧光定量PCR可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程，简化了摸索 PCR反应条件的繁琐实验，既节省实验时间提率，又节省实验成本。

当我们走出误区，想要选择一款自己需求的荧光定量PCR仪时我们又该关注些什么呢？

1、仪器的检测通量

在购买定量PCR仪的时候要根据实验实的需要来选择不同通量的仪器。目前市面上的荧光定量PCR的检测通量小到16个多到384个。如果进行一般的基因表达研究或病原体检测，实在不必购买昂贵的仪器，96孔的通量足够用；需要寻找要新药靶点和疾病标记的实验室可以考虑购买384孔板的仪器。假如经费有限无法购买384孔板仪器的实验室，可以考虑购买运行速度快（带有FAST模块）的96孔板荧光定量PCR仪。有了高通量的仪器，你会发现样品的制备和小体系、多样本的PCR体系构建成为限制实验速度和结果的颈瓶。Roche公司推出的MagnaPure核算纯化系统可配合Roche的Lightcycyler荧光定量PCR仪使用。Eppendorf 的ep Motion5070、5075全自动工作站，即可解决核酸纯化问题，又可进行96孔板、384孔板的PCR反应体系构建，不用加样加到眼发黑、手抽筋。

2、硬件设计特点

荧光定量PCR仪主要有传统的96孔板式、创新的离心式等，每种设计都有它的独到之处但也都有无法避免的缺憾。

传统的96孔板的荧光定量PCR可以容纳的样本量大，而且无需特殊的耗材。有些传统的96孔板的仪器采用卤钨灯激发、CCD检测，这些光学结构在96孔板的顶部，每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同——边缘效应，对结果产生影响。为了保证、准确的实验结果，这类仪器在实验过程中通常会使用ROX（一种荧光染料）或的Reference dye作为参照校正实验结果。卤钨灯的使用寿命短、更换成本较高已经成为很多用户头痛的问题。在实验过程中卤钨灯作为一种热光源，产生较多热能对实验结果有一定的影响。CCDzui大的优点就是可以同时扫描所有样品中的荧光信号，但是灵敏度较低，而且同时检测样品间的荧光信号存在干扰。像ABI、Bio-rad 公司生产的荧光定量PCR就属于这一种。但Bio-rad的IQ系列荧光定量PCR带有梯度功能。

创新的离心式的仪器通常选用LED激发、PMT检测，离心式的设计上避免了边缘效应。LED光源是冷光源对实验没有影响，因此无需采用其他荧光染料校正仪器，而且使用寿命长无需经常更换。PMT每次只能收集单个荧光信号，但是检测灵敏度高。但这类仪器运行速度非常快，但也存在样本量小、耗材昂贵、没有梯度功能、存在时间积分等缺点。Corbett 的Rotor-gene系列和Roche 的Lightcycler系列均为这一类仪器。

随着荧光定量PCR技术的使用，聪明的仪器生产商纷纷在传统的96孔板仪器上大作改进。首先是Stratagene的Mx3000p在检测上突破了使用CCD改用PMT检测荧光信号，大大提高了实验的灵敏度，但激发光源仍然沿用传统的卤钨灯并且没有梯度功能。Eppendorf 公司推出的Mastercycler ep realplex是一款带有梯度功能的荧光定量PCR仪，使用了96个LED为激发光源，采用先进的CPM（第二代PMT）及96合一光纤为检测系统，不但避免了边缘效应还保证所有样品间的荧光信号没有干扰。

3、运行速度

在荧光定量PCR仪的众多技术参数中，升降温速度也是厂家喜欢大力宣传的指标。更快的升降温，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间，提高PCR的特异性。为了更好的完成实验，各个厂家纷纷推出能快速运行的荧光定量PCR仪。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空气动力学原理，可在半小时左右完成30-40个循环。ABI的7500可以选配FAST模块拥有5°C/秒的升降温速度，可在40分钟左右完成30-40个循环。zui近eppendorf新推出的Mastercycler ep realplex4S 和2S的银质模块荧光定量PCR仪 ，升降温的速度可达到6℃/秒和4.5/秒，是目前同类产品中升降温速度zui快的荧光定量PCR 仪。一个在其他仪器上原本需要40—60分钟的PCR反应，eppendorf Mastercycler ep realplex4S 和2S （银质模块）只需运行28分钟——别小看这节约下来的几十分钟，一天下来就可以多运行好几轮了。

4、灵活性

大规模繁忙的实验室设备固然让人羡慕，但是常规实验室同样可以有精彩的选择。现在的仪器供应商拥有众多技术专家，有的还能提供整个分子生物学的基础研究平台，不但了解、满足您现在的需求，而且还考虑到了你可能变化的需求——升级和更换模块。Bio-rad的Mycycler就可以选择模块升级为定量PCR仪。ABI的7900可以选择将96孔槽变为384孔槽。像离心式的双通道的Rotor-gene3000A 就可以根据您研究的需要升级成四通道的荧光定量PCR仪。Eppendorf公司在这方面考虑的就更加周全，如实验室已经拥有Mastercycler ep可以按照您的要求升级为Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪，而且可升级的型号有4种：2通道银质、铝制模块和4通道银质、铝制模块。您可以根据自己的经费和实验需要购买、升级任何一款Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪。

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